Атф индуцированное изменение внутриклеточной концентрации кальция в нейронах неокортекса крыс

группы, способные к ионизации, три из которых имеют pKa ниже 3, а pKa

четвертой - 6,5 (Ленинджер, 1976). Таким образом, при pH 7,4 подавляющее

большинство молекул АТФ представляют собой четырехзарядные анионы АТФ4- ,

кроме того, в растворе присутствует небольшое количество АТФ3-.

2 Номенклатура и субклассификация пуринорецепторов.

Первое разделение пуринорецепторов на Р1 и Р2 типы основывалось на

следующем критерии: нуклеозиды такие как аденозин активировали Р1

пуринорецепторы, в то время как АТФ стимулировала Р2 пуринорецепторы, а

метилксантины (кофеин, теофиллин) являются селективными антагонистами Р1

пуринорецепторов. Также Р1 пуринорецепторы связаны с аденилатциклазой, а

активация Р2 пуринорецепторов может приводить к выработке простогландинов

(Burnstock 1978).

3 Р1 пуринорецепторы.

В 1979 году (Van Calker et al 1979) показали, что аденозиновые, Р1 -

пуринорецепторы можно подразделить на две группы. Рецепторы одной из них

обладали очень высоким сродством к аденозину (константа диссоциации Кd = 3 -

10 нМ). При взаимодействии аденозина с этой группой рецепторов наблюдалось

ингибирование аденилатциклазы и, следовательно, уменьшался уровень

внутриклеточного цАМФ. Этот класс рецепторов был назван А1 -рецепторами (Ri

рецепторы по (Londos et al 1980)). Аденозиновые рецепторы, относящиеся ко

второй группе, имели более низкое сродство к аденозину (Кd комплекса

аденозина с рецептором 5-10 мкМ). Активация этого типа рецепторов приводила

к стимуляции аценилатциклазы. Эти рецепторы Ван Колкер назвал А2-

рецепторами (Ra рецепторы по (Londos et al 1980)). Были обнаружены также и

мощные антагонисты для А1 - R-N6-Фенилизопропиладенозин (R-PIA). Для А2

более сильным антагонистом был 5’-N-этилкарбоксамидаденозин (NЕСА). Также

существуют работы, в которых описываются аденозиновые рецепторы, не

связанные с аденилатциклазой эти пуринорецепторы было предложено назвать А3

(Ribeiro and Sebastiao 1986). Предпосылкой к разделению А2 пуринорецепторов

на А2а и А2b подтипы стало открытие разного сродства NECA к Р1

пуринорецептору, - высокого в стриатуме (А2а) и низкого в фибробластах

(А2b) (Bruns et al 1986).

4 Р2 пуринорецепторы

Накопленные фармакологические доказательства, как-то: тип ответа, порядок

активности агонистов, десенситизация, вызываемая АТФ и ее структурными

аналогами, послужили основой для первого субделения Р2 пуринорецепторов. В

1985 году Бернсток и Кеннеди (10) указали на неоднородность популяции Р2-

пуринорецепторов. Этот вывод был сделан исходя из того, что в некоторых

тканях (например продольная мышца слепой кишки) АТФ вызывал расслабление

гладких мышц, а в других (мышечная стенка мочевого пузыря) - сокращение.

Первый подтип рецепторов был обозначен как Р2у, а второй - Р2х. Для Р2х

пуринорецепторов наиболее активным агонистом был (, ( - метилен АТФ ((,(-

мАТФ), а для Р2у - 2 - метилтио АТФ (2-МеSАТP). Так как порядок активности

лигандов может зависеть от скорости их гидролиза до неактивных соединений,

которая может значительно различаться в зависимости от ткани, более четким

доказательством для подразделения Р2 - рецепторов на подтипы служит наличие

селективных блокаторов. Сейчас известны селективные антагонисты как для

Р2х, так и Р2у-рецепторов для Р2х - (,(-мАТФ (десенситизирующее действие),

арилазидаминопропионил АТФ (АНАПП3), пиридоксалфосфат-6-азофенил-2’,4’-

дисульфидная кислота (PPADS), сурамин и другие; для Р2у пуринорецепторов -

реактив голубой 2, сурамин. В 1986 году Гордон (23) предложил выделить из

класса Р2 пуринорецепторов еще два подтипа Р2t и Р2z. Первый рецептор

располагается в тромбоцитах и управляет их агрегацией. Он, в отличие от

всех остальных подтипов P2 - рецепторов, активируется АДФ, и блокируется

АТФ. Р2z рецепторы расположены в тучных клетках. В них АТФ в очень больших

концентрациях (> 100 мкМ), а точнее четырехзарядный анион АТФ4-, вызывал

кальцийзависимую секрецию гистамина. Другие пуриновые нуклеотиды, включая

негидролизуемые аналоги АТФ, не активировали рецептор. Также был обнаружен

неселективный антагонист данного типа рецепторов DIDS - аналог PPADS

(Soltoff et al 1993). В 1991 году O’Connor предложил так называемый

нуклеотидный рецептор одинаково чувствительный как к АТФ, так и к УТФ, но

не чувствительный к 2 - MeSATP. Этот рецептор получил обозначение Р2u.

Возможным антагонистом данного рецептора является сурамин. Также было

обнаружено, что аденин динуклеотид полифосфаты также присутствуют в

фармакологической периферии (Hoyle 1990). Hildermann (1991)

индентифицировал сайт связывания для диаденозин тетрафосфата ( Ap4A) в

мозге крысы, который получил название дипуринергического рецептора, а

позднее Р2d (Pintor et al 1993). Антагонисты данного вида пуринорецепторов

пока не обнаружены.

|пуринорецепторы |

| | |

|Р1 - пуринорецепторы | |Р2 - пуринорецепторы |

| | | | | | | | | | | |

| | | | | | | | | | | | | | | | | | |

|A1 | |A2a |A2b | |A3 | |P2x | |P2y | |P2t| |P2z| |P2u | |P2d |

Таблица 1. Классическая схема субклассификации пурино-рецепторов.

5 Реклассификация пуринорецепторов.

Из - за всевозрастающих трудностей и несогласований в классической схеме

классификации Р2 пуринорецепторов и увеличивающемся числе подтипов

рецепторов, стало очевидным, что классическая схема требует пересмотра. В

1994 году Abbracchio and Burnstock предложили новую схему классификации Р2

- пуринорецепторов. Из всех Р2 - пуринорецепторов они вычленили три

основных семейства: Р2Х семейство, связанное с ионотропными каналами,

которое включало четыре подтипа; Р2У - связанное с активацией G - белков,

включающее семь подтипов и семейство Р2Z - семейство неселективных пор. Их

гипотеза основывалась в основном на изучении литературных источников и

анализе фармакологического профиля новообнаруженныж агонистов. В дальнейшем

теория подтвердилась клонированием различных подтипов Р2 -

пуринорецепторов. В настоящее время семейство Р2Х насчитывает шесть, а Р2У

- семь подклассов. Благодаря интенсивным исследованиям, практически не

остается сомнений в том, что данные семейства будут расти и дальше (Collo

et al 1996).

|Р2 - пуринорецепторы |

| | | |

| |P2Z - неселективные поры | |

| | | |

|Р2Х - семейство | |Р2У - семейство |

|ионотропных | |метаботропных |

|рецепторов | |рецепторов |

| | | | | | | | | | | | | | | |

| | | | | | | | |

|Р2Х1|Р2Х2|Р2Х3|Р2Х4|Р2Х5|Р2Х6|Р2У1|Р2У2|Р2У3|Р2У4|Р2У5|Р2У6|Р2У7|

Таблица 2. Современная классификация Р2 типа пуринорецепторов.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1 Подготовка препарата

Исследования проводились на пирамидальных нейронах моторной области

новой коры в тонких срезах мозга, выделенного из 14 дневных крыс. После

декапитации мозг помещался в холодный солевой раствор (0 - 40С). Процедура

от начала декапитации до выделения мозга длилась не более 60-90 секунд.

Затем мозг закреплялся полиакриламидным клеем на подложке вибротома

(Campden, Campden Instruments LTD, U.K.); камера вибротома заливалась

холодным солевым раствором. Срезы нарезались сагитально толщиной 250 - 300

мкм; скорость подачи лезвия - 1 см/с с частотой 10 Гц. После приготовления

срезы помещались в раствор постоянно насыщаемый карбогеном (5% СО2 + 95%

О2). Перед загрузкой флуоресцентным красителем срезы инкубировались в

постоянно оксигенируемом растворе 30 минут при температуре 32 градуса.

Окраска среза осуществлялась в течении 30 - 35 минут в СО2 насыщенном

термостате при температуре 35 градусов. После окраски срезы отмывались 1 -

1,5 часа в постоянно оксигенируемом растворе при комнатной температуре. Все

эксперименты проводились при температуре 32 градуса.

2 Характеристики кальциевого зонда

[pic]

Для количественного определения концентрации кальция в пирамидальных

нейронах моторной области новой коры использовался краситель Фура-2 AM

(рисунок 2) (16).

[pic]

На рисунке 3 представлен спектр зонда Фура -2 AM. При связывании с

кальцием происходит характерное изменение спектра возбуждения этого

красителя: при возбуждении светом с длиной волны 390 нм происходит

уменьшение флуоресценции, а при возбуждении светом, с длиной волны 340 нм -

увеличение. Однако, 340 нм является уже ультрафиолетовым светом, и для ее

использования необходим микроскоп с кварцевыми линзами. Поскольку в нашем

случае был использован обычный микроскоп, то вторая волна была выбрана

длиной 390 нм. 360 нм - это изобестическая точка зонда Фура -2, т.е.

флуоресцентный сигнал при возбуждении светом этой длины волны не зависит от

концентрации Ca2+ и есть функция лишь концентрации зонда.

Измерение флуоресценции при возбуждении двумя длинами волн позволяет

легко рассчитать [Ca2+]i в клетке по формуле (24):

[Ca2+]i= Kd * b * (R - Rmin)/(Rmax-R)

где Кd - константа диссоциации комплекса Фура -2 с кальцием,

R=F360/F390 - текущее отношение флуоресцентных сигналов, Rmin =

F360/F390|Ca0 - то же отношение в растворе с низкой концентрацией Ca2+,

Rmax = F360/F390|CaҐ - то же отношение в растворе с высокой концентрацией

Ca2+, b = F390|Ca0/F390|CaҐ - отношение флуоресцентных сигналов в низкой и

высокой концентрации Ca2+ при возбуждении длиной волны 390 нм. Параметры

Rmin, Rmax и b определяли экспериментально. Для этого были приготовлены

базовый раствор (в ммоль/л) : KCl - 100, Tris-Cl - 10 (pH=7.2), Фура -2 -

0.005; раствор с низкой концентрацией Ca2+ готовился без добавления Ca2+ с

добавкой EGTA - 10; раствор с высокой концентрацией Ca2+ - с добавкой CaСl2

- 10. Отношение величин флуоресценции определялось в каплях приведенных

выше растворов, помещенных на дно экспериментальной камеры. В результате

для нашей системы Rmin= 0.33, Rmax= 8.9 и b=12.8. Параметр Кd был взял из

работы [Grinkiewicz et al, 1985] и равнялся 224 нмоль/л.

3 Окраска срезов флуоресцентным красителем

Для введения кальций - чувствительного зонда в клетку, срезы

инкубировались в растворе Тироде, содержащим эстерифицированную

незаряженную форму красителя Фура-2 ацетоксиметилэстер в концентрации 5

мкмоль/л, растворенную в диметилсульфоксиде с добавлением детергента

Плуроник F-127 (0.02%). В такой форме краситель проникает в клетку, затем

эндогенными эстеразами эфирные группы отщепляются, зонд становится

заряженным и покинуть клетку не может. Окраска производилась 20 минут при

температуре 35оС. Концентрация зонда в клетке определялась путем титрования

окрашенных клеток раствором красителя, который добавлялся во внеклеточный

раствор. Оцененная таким способом концентрация зонда в клетке была в

диапазоне 30 - 70 мкмоль/л.

4 Структура экспериментальной установки для двух-волнового измерения

концентрации кальция

Принципиальная схема установки представлена на рисунке 4. Основными

элементами ее являются: источник света, система смены фильтров, микроскоп,

ФЭУ, модуль предварительной обработки сигнала и компьютер.

Источником возбуждающего света служит ртутная лампа мощностью 50 ватт.

Поскольку в качестве кальций - чувствительного зонда использовали индикатор

Фура -2 АМ, являющийся по возбуждению двухволновым (см. выше), то для

количественного определения [Ca2+]i необходимо было одновременно

индуцировать флуоресценцию обеими длинами волн. В нашей конфигурации

периодическая смена фильтров возбуждения была реализована при помощи

вращения колеса с вмонтированными в него двумя интерференционными фильтрами

360 и 390 нм. Частота вращения была 5 Гц. Управление системой смены

фильтров осуществлялось при помощи кальций - измерительного модуля фирмы

Luigs und Neumann, Германия. Этот же модуль являлся интерфейсом

предварительной обработки.

Оптическая часть установки была смонтирована на базе микроскопа

Axioskop, Zeiss. Разделение потоков возбуждающего света и флуоресценции

производилось при помощи дихроического зеркала. Свет, прошедший через

фильтр для возбуждения флуоресценции, отклонялся дихроическим зеркалом и

при помощи высокоаппертурного иммерсионного объектива (40*, апертура 0.75)

фокусировался на объекте. Флуоресцентный свет проходил через

соответствующий интерференционный фильтр и подавался на фотоэлектронный

умножитель (ФЭУ). Для уменьшения уровня шумов фиксированная диафрагма (1

мм) была расположена перед ФЭУ. В результате флуоресцентный сигнал

собирался с фокальной плоскости диаметром 50 мкм, что позволило значительно

улучшить соотношение сигнал/шум.

Модуль предварительной обработки позволял производить компенсацию

автофлуоресценции и, при необходимости, усиливать сигнал, после чего он

оцифровывался при помощи цифрового интерфейса TIDA и обрабатывался

компьютером при помощи программ Tida 5.0 и Wintida, разработанных в

Гейдельберге, Германия.

[pic]

Рисунок 4. Принципиальная схема экспериментальной установки для

двухволнового измерения кальция.

5 Растворы и смена растворов

При работе со срезами все растворы готовились на основе раствора Тироде

(в ммоль/л): NaCl - 125, KCl - 5.4, MgCl2 - 1, CaCl2 - 2.5, NaHCO3 - 26,

KH2PO4 - 1.6, глюкоза - 10, постоянно аэрировавшийся газовой смесью 95% О2

+ 5% СО2 (pH=7.4). Бескальциевый раствор готовился эквимолярной заменой

CaCl2 на MgCl2 и добавкой 1 ммоль/л EGTA, растворы с повышенным содержанием

калия или кофеина - заменой NaCl на соответствующее количество KСl или

кофеина.

Смена растворов производилась протоком, скорость которого можно было

варьировать от 10 до 20 мл/мин. Объем экспериментальной камеры составлял

0.5 мл. Все эксперименты были проведены при температуре (32 (С).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

[pic]

Аппликация АТФ в большинстве нейронов моторной коры (98 из 102)

вызывает быстрое и кратковременное повышение концентрации цитозольного

кальция [Ca2+]i . Концентрация [Ca2+]i достигает своего максимума на

протяжении 6-8 секунд и затем восстанавливается до базального уровня при

продолжающемся присутствии АТФ. Отмывание АТФ приводит к восстановлению

[Ca2+]i до уровня покоя. Характерный вид АТФ - индуцированного кальциевого

транзиента представлен на рисунке 5.

[pic]

Амплитуда АТФ - индуцированного кальциевого транзиента варьировалась в

пределах от 50 до 450 нМ. Среднее значение выброса [Ca2+]i вызванного

приложением АТФ в концентрации 100 мкМ находилось в пределах 200-250 нМ.

Наблюдалась доза - зависимость амплитуды ответа от концентрации АТФ в

пределах от 10 до 2000 мкМ. На рисунке 7 представлена апроксимация

экспериментальных точек сигма - функцией. Концентрация АТФ, при которой

амплитуда ответа составляет половину максимальной, - 220 ± 20 мкМ.

[pic]

Целью наших исследований было определение подтипов пуринорецепторов

вовлеченных в генерацию [Ca2+]i транзиента. Известно, что АТФ активирует

несколько типов пуринорецепторов, а именно Р2 пуринорецепторы подтипов Р2х

и Р2у (Peter Illes et al, 1993, Burnstock and Kennedy 1985), а также Са2+

каналы плазмалеммы (Кришталь, 1983).

С целью обеспечения достоверности полученных данных, принимая во

внимание тот факт, что работа проводилась на тонких срезах мозга, мы

провели серию экспериментов с подавлением распостранения потенциалов

действия с помощью тетродотоксина (TTX). При использовании TTX выяснилось,

что амплитуда и форма [Ca2+]i транзиентов не изменяется или изменяется

незначительно. Полученные результаты позволяют нам предполагать, что

получаемые нами данные отображают процессы происходящие в отдельной

наблюдаемой клетке. К сожалению мы не имели возможности проводить все

эксперименты c тетродотоксином из-за дороговизны препарата. Для изучения

характеристик рассматриваемых пуринорецепторов, принимающих участие в

генерации [Ca2+]i транзиента, применялись следующие протоколы

экспериментов.

1. Приложение АТФ в растворе не содержащем Ca2+. Удаление кальция из

внеклеточного раствора незначительно влияло на кальциевый транзиент,

вызванный аппликацией 10 мкМ АТФ, но в тоже время подавляло на 45% ±

7% кальциевый транзиент вызванный 100 мкМ АТФ. (Рис. 8).

[pic]

1. Для исследования способности внутриклеточного Ca2+ депо к

перезаполнению мы последовательно апплицировали АТФ несколько раз с

интервалом в 60 секунд в обычном растворе и в растворе не содержащем

Ca2+ . Как видно из рисунка 9 вторая аппликация АТФ вызывала Ca2+

транзиент меньшей (на 30% ( 4%) амплитуды по сравнению с первой

(контрольной) аппликацией. Последующие аппликации АТФ разделенные 60

ти секундным интервалом не вызывали заметного уменьшения амплитуды

[Ca2+]i транзинета по сравнению со второй аппликацией в стандартном

растворе

[pic]

В бескальциевом растворе - наоборот, вторая аппликация АТФ вызывала

Страницы: 1, 2, 3