Генная инженерия

Метод трансформации основывается на природной способности бактерий

Agrobacterium tumefaciens генетически модифицировать растения.

Реконструированные штаммы Agrobactrium, содержащие неонкогенные варианты Ti-

плазмид и обладающие повышенной вирулентностью, стали основой одного из

наболее популярных методов трансформации. Первоначально трансформация

применялась для генно-инженерных двудольных растений, однако работы

последних лет свидетельствуют, что этот метод эффективен и в отношении

кукурузы, риса, пшеницы. Другим широко распространённым методом

трансформации, является технология, основанная на обстреле ткани

микрочастицами золота (или других тяжелых металлов), покрытыми раствором

ДНК. Все выращиваемые ныне коммерческие сорта получены с помощью названных

выше двух методов.

Современный арсенал методов трансформации, однако, довольно обширен и

включает такие подходы, как введение ДНК в голые клетки (протопласты),

электропорация клеток, микроинъекций ДНК в клетки, прокалывание клеток

путём встряхивания их в суспензии микроигл, опосредованная вирусами

инфекции и так далее.

Генетические изменённые растения с устойчивостью к различным классам

гербицидов в настоящее время являются наиболее успешным биотехнологическим

продуктом. Дело в том, что биотехнология позволила совершить такой прыжок,

так как оказалось возможным генетически изменять устойчивость растений к

тем или иным гербицидам либо путем введения генов, кодирующих белки,

нечувствительные к данному классу гербицидов, либо за счет введения генов,

обеспечивающих ускоренный метаболизм гербицидов растений. К настоящему

времени клонированы гены, кодирующие нечувствительные к действию гербицидов

ферменты-мишени, что дало возможность получать трансгенные растения,

устойчивые к таким гербицидам, как глифостат и хлорсульфуроновым, и

имидазолиноновым гербицидом. Изолированы также гены, которые кодируют

ферменты деградации некоторых гербицидов, что позволило получить

трансгенные растения устойчивые к фосфинотрицину и далапону. В 1997 году

устойчивая к Roundup соя, распространяемая компанией "As Grow", была

признана в США сельскохозяйственным продуктом года.

Ученые пошли далее. Так как множество растений подвержены нападению и

поеданию со стороны насекомых, то ученые генной инженерии провели

эксперимент с давно известной бактерией Bacillus-Thiringiensis, которая

продуцирует белок, оказалось она является очень токсичной для многих видов

насекомых, но в то же время безопасна для млекопитающих., белок (дельта-

эндотаксин, CRY-белок) продуцируется различными штамами Bacillus-

Thiringiensis. Это прототаксин который расщепляется в кишечнике насекомых,

образуя активированный токсин. Активизированный белок специфично

связывается с рецепторами средней кешки насекомых, что приводит к

образованию пор и лизису клеток кишечного эпителия. Взаимодействие токсинов

с рецепторами строго специфично, что усложняет подбор комбинации токсин-

насекомое. В природе найдено большое количество штаммов Bacillus-

Thiringiensis, чьи токсины действуют только на определенные виды насекомых.

Препараты Bacillus-Thiringiensis в течение десятилетий использовались для

контроля насекомых на полях.

Встраивание гена этого белка в геном растений дает возможность получить

трансгенные растения, не поедаемые насекомые. Но этот метод потребовал

большой работы со стороны генной инженерии, в плане подборов необходимых

штаммов и созданию генно-инженерных конструкций, которые дают наибольший

эффект для конкретных классов насекомых. Кроме видоспецифичности по

действию на насекомых встраивание прокариотических генов дельта-токсинов в

геном растений даже под контролем сильных эукариотических промоторов не

привело к высокому уровню экспрессии. Предположительно такое явление

возникло в связи с тем, что эти бактериальные гены содержат значительно

больше адениновых и тиминовых нуклеатидных оснований, чем растительная ДНК.

Эта проблдема была решена путем создания модефицированных генов, где один

из природного гена вырезали и добавили те или иные фрагменты с сохранением

доменов, кодирующих активные части дельта-токсинов. Так, например, с

помощью таких подходов был получен картофель, устойчивый к колорадскому

жуку. В настоящее время так называемый Bt – растения хлопка и кукурузы

занимают основную долю в общем объеме генетически модифицированных растений

этих культур, которые выращивают на полях США.

3.1.1 Изменение свойств сельскохозяйственных технических растений

Современная биотехнология в состоянии манипулировать многими важнейшими

признаками, которые можно разделить на три группы:

1. Сельскохозяйственные производства. К ним можно отнести общей

продуктивности растений за счет регулирования синтеза фитогормонов

или дополнительного снабжения кислородом растительных клеток, а

также признаки обеспечивающие устойчивость к разного рода

вредителям, кроме этого в создании форм растений с мужской

стерильностью и возможностью дольше сберегать урожай.

2. К признакам которые влияют на качество продукции, относится

возможность манипулировать молекулярным весом жирных кислот.

Растения будут производить биодеградирующий пластик, по цене

сопоставимой с полиэтиленом, получаемым из нефти. Открылась

возможность получения крахмала с заданными физико-химическими

свойствами. Аминокислотный состав у растений запасных белков

становится более сбалансированным и легко усвояем для млекопитающих.

Растения становятся продуцентами вакцин, фармакологических белков и

антител, что позволяет удешевить увеличение разных заболеваний, в

том числе и онкологических. Получены и испытываются трансгенные

растения хлопка с уже окрашенным волокном, более высоким качеством.

3.1.2. Генетическая модификация пластид.

Во многих случаях генетической модификации будут подвергаться не

ядерные геномы, а геномопластит или метохондрия. Такие системы позволяю

значительно увеличить содержание продукта в трансгенном материале.

В генной инженерии исследуются следующие направления:

- Управляемая активность генов;

- Селективная экспрессия трансгена в определенных тканях;

- Система экспрессии растения в чужеродной генетической

информации, опосредованной вирусами.

Разработанная усилиями компании “Biosource” (США) технология позволяет

быстро и в больших количествах нарабатывать в растениях белки и небольшие

молекулы за счет инфицирования растений генетически модифицированными

вирусами, со встроенными чужеродными генами тех или иных белков. За этой

системой большое будущее так как она позволяет изменить биосинтетические

процессы в растениях без длительных и дорогостоящих манипуляций с

растительным геномом.

3.3. ГЕННЫЕ ВАКЦИНЫ

3.2.1. Актуальность разработки новых вакцин

Вакцины — одно из самых значительных достижений медицины, их

использование к тому же чрезвычайно эффективно с экономической точки

зрения. В последние годы разработке вакцин стали уделять особое внимание.

Это обусловлено тем, что до настоящего времени не удалось получить

высокоэффективные вакцины для предупреждения многих распространенных или

опасных инфекционных заболеваний. По данным созданной в прошлом году

международной организации «Всемирный союз по вакцинам и иммунизации» (в

числе ее участников — ВОЗ, ЮНИСЕФ, Международная федерация ассоциаций

производителей фармацевтической продукции, Программа Билла и Мелинды Гейтс

по вакцинации детей, Рокфеллеровский фонд и др.), в настоящее время

отсутствуют эффективные вакцины, способные предупредить развитие СПИДа,

туберкулеза и малярии, от которых в 1998 г. умерло около 5 млн человек.

Кроме того, увеличилась заболеваемость, обусловленная теми инфекциями, с

которыми человечество ранее успешно боролось. Этому способствовало

появление лекарственно-устойчивых форм микроорганизмов, увеличение числа

ВИЧ-инфицированных пациентов с иммунной недостаточностью, ослабление систем

здравоохранения в странах с переходной экономикой, увеличение миграции

населения, региональные конфликты и др. При этом распространение

микроорганизмов, устойчивых к воздействию антибактериальных препаратов,

приобрело характер экологической катастрофы и поставило под угрозу

эффективность лечения многих тяжелых заболеваний. Повышенный интерес к

вакцинам возник после того, как была установлена роль патогенных

микроорганизмов в развитии тех заболеваний, которые ранее не считали

инфекционными. Например, гастриты, пептическая язва желудка и

двенадцатиперстной кишки, ассоциированная с H. pylori, злокачественные

новообразования печени (вирусы гепатита В и С).

Поэтому в последние 10–15 лет правительства многих стран стали

принимать меры, направленные на интенсивную разработку и производство

принципиально новых вакцин. Например, в США в 1986 г. был принят закон

(«National Vaccine Injury Compensation Act»), защищающий производителей

вакцин от юридической ответственности при подаче судебных исков, связанных

с развитием побочных реакций при вакцинации, если они не были обусловлены

ошибками при производстве вакцины. С изменением ситуации увеличился и

мировой рынок вакцин, объем продаж которого в 1998 г. составил 4 млрд

долларов США в стоимостном выражении. Однако многие считают, что в

ближайшие годы этот сектор фармацевтической промышленности будет

развиваться гораздо быстрее. Так, согласно публикациям в американском

журнале «Signals Magazine» (январь 1999 г.), который освещает ситуацию в

современной биотехнологической промышленности, объем продаж вакцин на

мировом рынке через 10 лет составит 20 млрд долларов США. Этот прогноз

принадлежит М. Греко, исполнительному директору компании «Merieux MSD»,

совместного предприятия крупнейших производителей вакцин — компаний

«Pasteur Merieux Connaught» (теперь «Aventis Pasteur») и «Merck & Co.».

3.2.2.Разработка ДНК-вакцин

Используемые сегодня вакцины можно разделить в зависимости от методов

их получения на следующие типы:

• живые аттенуированные вакцины;

• инактивированные вакцины;

• вакцины, содержащие очищенные компоненты микроорганизмов (протеины или

полисахариды);

• рекомбинантные вакцины, содержащие компоненты микроорганизмов, полученные

методом генной инженерии.

Технологию рекомбинантной ДНК применяют также для создания живых

ослабленных вакцин нового типа, достигая аттенуации путем направленных

мутаций генов, кодирующих вирулентные протеины возбудителя заболевания. Эту

же технологию используют и для получения живых рекомбинантных вакцин,

встраивая гены, кодирующие иммуногенные протеины, в живые непатогенные

вирусы или бактерии (векторы), которые и вводят человеку.

|[pic] |

|Рис. 5. Одноразовый генный пистолет компании |

|«Powderject» |

|а — внешний вид; б — в разрезе |

| |

В 1990 г. в некоторых исследовательских лабораториях приступили к

разработке новых вакцин, которые основаны на введении «голой» молекулы ДНК.

Уже в 1992–1993 гг. несколько независимых групп исследователей в результате

эксперимента доказали, что введение чужеродной ДНК в организм животного

способствует формированию иммунитета.

Принцип применения ДНК-вакцин заключается в том, что в организм

пациента вводят молекулу ДНК, содержащую гены, кодирующие иммуногенные

белки патогенного микроорганизма. ДНК-вакцины называют еще генными,

генетическими, полинуклеотидными вакцинами, вакцинами из нуклеиновых

кислот. На совещании специалистов по генным вакцинам, проведенном в 1994 г.

под эгидой ВОЗ, было решено отдать предпочтение термину «вакцины из

нуклеиновых кислот» с их подразделением соответственно на ДНК- и РНК-

вакцины. Такое решение основывалось на том, что употребление термина «ДНК-

вакцина» не сформирует ошибочное мнение о том, что новые вакцины вносят

изменения в генетические структуры организма вакцинируемого человека. Тем

не менее, многие специалисты считают более точным термин «генные вакцины»

(поскольку иммунная реакция направлена не против ДНК, а против антигенного

белка, кодируемого геном), который также часто применяют.

Для получения ДНК-вакцин ген, кодирующий продукцию иммуногенного

протеина какого-либо микроорганизма, встраивают в бактериальную плазмиду.

Плазмида представляет собой небольшую стабильную молекулу кольцевой

двухцепочечной ДНК, которая способна к репликации (воспроизведению) в

бактериальной клетке. Кроме гена, кодирующего вакцинирующий протеин, в

плазмиду встраивают генетические элементы, которые необходимы для

экспрессии («включения») этого гена в клетках эукариотов, в том числе

человека, для обеспечения синтеза белка. Такую плазмиду вводят в культуру

бактериальных клеток, чтобы получить большое количество копий. Затем

плазмидную ДНК выделяют из бактерий, очищают от других молекул ДНК и

примесей. Очищенная молекула ДНК и служит вакциной. Введение ДНК-вакцины

обеспечивает синтез чужеродных протеинов клетками вакцинируемого организма,

что приводит к последующей выработке иммунитета против соответствующего

возбудителя. При этом плазмиды, содержащие соответствующий ген, не

встраиваются в ДНК хромосом человека.

ДНК-вакцины можно вводить в солевом растворе обычным парентеральным

способом (внутримышечно, внутрикожно). При этом бoльшая часть ДНК поступает

в межклеточное пространство и только после этого включается в клетки.

Применяют и другой метод введения, используя так называемый генный пистолет

(рис. 5, 6). Для этого ДНК фиксируют на микроскопических золотых гранулах

(около 1–2 мкм), затем с помощью устройства, приводимого в действие сжатым

гелием, гранулы «выстреливают» непосредственно внутрь клеток. Следует

отметить, что аналогичный принцип введения лекарства с помощью струи

сжатого гелия используют и для разработки новых способов доставки

лекарственных средств (с этой целью оптимизируют размеры частиц

лекарственного вещества и их плотность для достижения необходимой глубины

проникновения в соответствующую ткань организма). Этот метод требует очень

небольшого количества ДНК для иммунизации. Если при иммунизации

классическими субъединичными вакцинами вводят микрограммы протеина, то при

использовании ДНК-вакцины — нанограммы и даже меньше. Говоря о минимальном

количестве ДНК, достаточном для индукции иммунного ответа, С.А. Джонстон,

директор Центра биомедицинских изобретений Техасского университета, в

журнале «The Scientist» (1998) отмечает, что с помощью генного пистолета

можно однократно ввести мыши «фактически 27 тыс. различных плазмид и

получить иммунный ответ на индивидуальную плазмиду».

|[pic] |

|Рис. 6. Многоразовый генный пистолет компании |

|«Powderject» |

|а — сменный картридж; б — прибор в полной сборке |

| |

Последующие эксперименты подтвердили способность ДНК-вакцин формировать

иммунитет в отношении разнообразных возбудителей.

Потенциальные преимущества ДНК-вакцин

ДНК-вакцины обладают рядом преимуществ по сравнению с традиционными

вакцинами.

3.2.3. Повышение эффективности и безопасности иммунизации

1. Способствуют выработке антител к нативной молекуле вирусных

протеинов.

Если в качестве вакцины использовать иммуногенные протеины, то в

процессе их производственного получения и очистки могут произойти изменения

трехмерной конфигурации этих молекул. Поэтому иммунизация может быть

низкоэффективной в связи с образованием антител, специфичных к измененным

иммуногенным молекулам, но не к нативным вирусным протеинам. Введение ДНК-

вакцин, как правило (см. «возможные ограничения в применении ДНК-вакцин»),

приводит к синтезу клетками вирусных антигенов в их нативной форме.

2. Способствуют выработке цитотоксических Т-лимфоцитов.

Инактивированные или субъединичные вакцины в основном индуцируют

гуморальный иммунный ответ. Это обусловлено тем, что характер механизмов

представления и распознавания антигенов клетками иммунной системы зависит

от того, синтезируется ли антиген в клетке или поступает в нее извне. А от

этого в свою очередь зависит характер активации и взаимодействия клеток,

участвующих в иммунном ответе. Поскольку ДНК-вакцины обеспечивают синтез

иммунногенных белков клетками самого организма, они способствуют

формированию как гуморального, так и клеточного иммунитета. Активация

цитотоксических Т-клеток без введения живого патогена является важнейшей

отличительной чертой ДНК-вакцин.

3. Могут избирательно воздействовать на различные субпопуляции Т-

лимфоцитов.

В принципе возможна разработка ДНК-вакцин, которые избирательно

активируют разные типы хелперных Т-лимфоцитов. Благодаря этому могут быть

созданы генные вакцины для лечения лиц с аутоиммунными или аллергическими

заболеваниями, патогенез которых связан с нарушением различных звеньев

Страницы: 1, 2, 3, 4