Учебное пособие: Инфракрасная спектроскопия и спектроскопия кругового дихроизма. Методы определения вторичной структуры белков
Авторы метода использовали для анализа шесть типов вторичной
структуры белка: упорядоченная (Ho) и неупорядоченная
(Hd) формы a-спирали,
упорядоченная (Вo) и неупорядоченная (Вd) формы b-структуры,
b-изгиб (Т) и остальные формы (R). К неупорядоченной форме a-спирали
были отнесены по два аминокислотных остатка с каждой стороны спирального сегмента,
а к неупорядоченной форме b-структуры -
аминокислотные остатки b-нитей, образующие
"неклассические" водородные связи.
Применение к выбранному базисному набору метода "ортогональных
спектров" [6] привело к получению 11 ортогональных спектров, амплитуда которых
превышает экспериментальную ошибку, возникающую при регистрации ИК-спектров. Пять
"наиболее значимых" ортогональных спектров показано на рисунке 2.2.2.
Экспериментальная проверка точности анализа ИК-спектров белков
на белках из базисного набора дала следующие коэффициенты корреляции (смотри раздел
1.2):
Метод |
Ho
|
Hd
|
Bo
|
Bd
|
T |
R |
"регуляризации" |
0.97 |
0.77 |
0.94 |
0.91 |
0.80 |
0.48 |
"ортогональных спектров" |
0.98 |
0.80 |
0.93 |
0.90 |
0.75 |
0.48 |
"регуляризации" (без исключения поглощения боковых групп
аминокислот) |
0.92 |
0.68 |
0.85 |
0.90 |
0.53 |
0.32 |
2.3 Работа с пакетом программ STRUC по анализу ИК-спектров белков
Пакет программ STRUC разработан в институте белка РАН [10]. Он предназначен для анализа
инфракрасных спектров поглощения белков и определения их вторичной структуры. Алгоритм
анализа спектров основан на оригинальном методе авторов программы [8-10] (смотри
выше). Пакет STRUC состоит из следующих
программ и вспомогательных файлов:
- STRUC.BAT - командный файл, используемый
для определения вторичной структуры белка. Он организует работу следующих трех программ:
- AMACIR (файл amacir.exe)
- программа, исключающая из ИК-спектра поглощения белка вклад от поглощения боковых
групп аминокислотных остатков по методу [8];
- SVDIR (файл svdir.exe)
- программа, определяющая вторичную структуру белка методом "ортогональных
спектров" [6];
- CONTIR (файл contir.exe)
- программа, определяющая вторичную структуру белка методом "регуляризации"
[4].
- VISUAL.BAT - командный файл, предназначенный
для графического воспроизведения ИК-спектра поглощения белка. Он организует работу
следующих двух программ:
- PLOTFL (файл plotfl.exe)
- программа, осуществляющая преобразование спектров поглощения к формату, используемому
программой PLOTNIK;
- PLOTNIK (файл plotnik.exe) - программа, осуществляющая графическое построение ИК-спектра
поглощения белка.
- SOURCE - файл, содержащий входные данные для программы AMACIR (в том числе сам ИК-спектр поглощения белка).
- OUT.SVD и OUT.CON - файлы, являющиеся результатом
работы программ SVDIR и CONTIR, содержащие данные по оценке вторичной структуры белка
соответствующими методами.
Программы, входящие в пакет STRUC, не
имеют системы экранного интерфейса, и работа с ними осуществляется из командной
строки. Перед началом работы с пакетом необходимо создать текстовый файл SOURCE (рекомендуется скопировать уже имеющийся) и записать в
него исходные данные по исследуемому белку и его ИК-спектру поглощения, необходимые
для работы программ. Формат этого файла следующий:
Номер строки |
Содержание |
1 |
Идентификатор файла (длиной не более 70 символов) |
2, 3 |
Формат записи числовых значений спектра в строках 6 - 14. По умолчанию
устанавливается формат (10F6.0) - по 10 значений в каждой
строке в форме действительного числа с фиксированной десятичной точкой, причем
на запись всего числа отводится 6 позиций, из которых 0 позиций - на десятичную
часть. (Для действительных чисел с плавающей десятичной точкой вместо символа
'F' следует записать символ 'E'.) |
5 |
Спектральный диапазон (по волновым числам), используемый для вычислений,
и число точек в спектре. Максимально допустимый спектральный диапазон составляет
1800 - 1480 см-1 при числе точек в спектре, равном 81. При задании
диапазона и числа точек необходимо сохранять интервал между точками равным 4 см-1.
|
6 - 14 |
ИК-спектр поглощения белка, выраженный в единицах л моль-1·см-1.
|
17 |
Содержит единственный символ '*', положение которого определяет тип
записи данных по аминокислотному составу белка: (а) NAmAc
- указывается абсолютное количество остатков каждой аминокислоты в белке; (б)
NAmAc/N - указывается абсолютное
количество остатков каждой аминокислоты в белке, деленное на общее количество
аминокислотных остатков. |
19 - 40 |
Аминокислотный состав белка. Здесь же отдельно указываются N - и C-концевые группы белка. |
42 |
Общее количество аминокислотных остатков в белке и значение pH, при котором снимался спектр. Указывать значение pH нужно обязательно, а общее количество
аминокислотных остатков - только в том случае, если при записи аминокислотного
состава белка записывались относительные доли аминокислотных остатков (вариант
(б)). |
43 |
Комментарий к файлу |
Пример заполнения файла можно посмотреть в уже имеющемся файле
SOURCE.
После подготовки файла SOURCE необходимо запустить вычисления. Для этого в командной строке
следует ввести
STRUC SOURCE OUT.SVD OUT.CON и нажать
кнопку [Enter]. (Названия файлов SOURCE,
OUT.SVD и
OUT.CON могут
быть любыми, следует лишь соблюдать указанный порядок пр их записи.)
После окончания работы программ результаты вычислений моут быть
просмотрены в файлах OUT.SVD и OUT.CON с помощью любого текстового редактора. Первая часть этих файлов
содержит информацию о входных данных (взятую из файла SOURCE).
Далее следует набор решений, соответствующий различным комбинациям ортогональных
спектров (в файле OUT.SVD) или различным
значениям параметра регуляризации (в файле OUT.CON). В конце файлов приводится аппроксимированный спектр и окончательно
выбранное решение.
Можно просмотреть также промежуточные результаты вычислений программ.
Файл PEPT, создаваемый программой AMACIR,
содержит ИК-спектр поглощения пептидной цепи. Этот файл является входным для программ
SVDIR и CONTIR.
Файл AMACIR.RES, также создаваемый
программой AMACIR, содержит данные об ионизации отдельных
аминокислотных остатков при заданном значении pH, среднем
значении массы одного аминокислотного звена данного белка, содержании в белке азота,
а также три ИК-спектра поглощения: спектр белка (определенный экспериментально)
и спектры боковых групп аминокислотных остатков и пептидной цепи (вычисленные программой
AMACIR).
Для того, чтобы построить все три спектра на экране, необходимо
запустить файл VISUAL.BAT.
В появляющемся после этого на экране главном меню программы PLOTNIK следует выбрать пункт Suit, позволяющий перейти в раздел задания параметров, необходимых
для построения графиков. Ниже перечислены основные из них:
Titles/X
Titles/Y
Scale/X/Upper
Scale/X/Lower
Scale/Y/Upper
Scale/Y/Lower
Misc/Npts
Misc/Data
|
Волновое число, 1/см
Коэффициент молярной экстинции, 1/ (моль см)
1480
1800
Auto
Auto
Auto
Formatted
|
Для одновременного построения трех графиков необходимо задать
три набора данных (A, B и C) и указать имена файлов, содержащих
эти данные:
Set |
Legend |
Filename |
A
B
C
|
экспериментальный спектр
спектр поглощения пептидной цепи
спектр поглощения а/к остатков
|
buf1.dat
buf2.dat
buf3.dat
|
Файлы buf1.dat, buf2.dat и buf3.dat создаются программой PLOTFL на
основе данных файла AMACIR.RES (эти файлы уничтожаются после
завершения работы программы PLOTNIK). После задания параметров
следует вернуться в главное меню программы PLOTNIK и выбрать в нем пункт View. При этом
на экране будут построены требуемые графики.
Список литературы
1.
Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия. Том 2: Методы исследования
структуры и функции биополимеров. М: Мир, 1984
2.
Saxena V.P., Wetlaufer D.B. (1971) A new basis for
interpreting the circular dichroic spectra of proteins. Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A.68, 969-972
3.
Сhang C.T., Wu C. -S.C., Yang J.T. (1978) Circular
dichroic analysis of protein conformation: inclusion of the b-turns. Anal.
Biochem.91, 13-31
4.
Provencher S.W., Glockner J. Estimation of globular
protein secondary structure from circular dichroism. (1981) Biochemistry
20, 33-37
5.
Hennessey J.P., Jr., Johnson W.C., Jr. (1981) Information
content in the circular dichroism of proteins. Biochemistry 20, 1085-1094
6.
Compton L.A., Johnson W.C., Jr. (1986) Analysis of
protein circular dichroism spectra for secondary structure using a simple matrix
multiplication. Anal. Biochem.155, 155-167
7.
Manavalan P., Johnson W.C., Jr. (1987) Variable selection
method improves the prediction of protein secondary structure from circular dichroism
spectra. Anal. Biochem.167, 76-85
8.
Venyaminov S.Yu., Kalnin N.N. (1990) Quantitative
IR specrtophotometry of peptide compounds in water (H2O) solutions.I.
Spectral parameters of amino acid residue absorption bands. Biopolymers 30,
1243-1257
9.
Venyaminov S.Yu., Kalnin N.N. (1990) Quantitative
IR specrtophotometry of peptide compounds in water (H2O) solutions. II.
Amide absorption bands of polypeptides and fibrous proteins in a-, b-, and random coil
conformations. Biopolymers 30, 1259-1271
10.
Kalnin N.N., Baikalov I.A., Venyaminov S.Yu. (1990)
Quantitative IR specrtophotometry of peptide compounds in water (H2O)
solutions. III. Estimation of the protein secondary structure. Biopolymers
30, 1273-1280
|